GST pull down實(shí)驗(yàn)技術(shù)

GST Pull down實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1. 實(shí)驗(yàn)原理

Pull down技術(shù)是將"誘餌"蛋白與一種易于純化的配體標(biāo)簽（如：GST標(biāo)簽、His標(biāo)簽）進(jìn)行融合表達(dá)，而帶標(biāo)簽的誘餌蛋白能被特異結(jié)合該標(biāo)簽的固相親和配基捕獲，形成"次級(jí)親和支持物"，用于純化與誘餌蛋白相互作用的其他蛋白。純化產(chǎn)物洗脫后，經(jīng)Western blot驗(yàn)證或LC-MS/MS，即鑒定與誘餌蛋白互作的蛋白。1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出GST融合蛋白。從此，GST融合蛋白在蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域里得到了極大的推廣。GST融合蛋白在經(jīng)過固定有谷胱甘肽（GSH）的色譜柱時(shí)，就可以通過GST與GSH的相互作用而被吸附。當(dāng)再有細(xì)胞抽提物過柱，就可以得到能夠與“誘餌"蛋白相互作用的興趣蛋白。GST pull down是一種體外驗(yàn)證或篩選互作蛋白的技術(shù)。

2. 實(shí)驗(yàn)流程

1. 構(gòu)建帶標(biāo)簽的誘餌蛋白原核表達(dá)載體（帶GST標(biāo)簽或His或）；

2. 載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)誘餌蛋白（關(guān)鍵步驟，很多蛋白原核表達(dá)時(shí)會(huì)形成包涵體，極大地影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。我們采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，能有效降低包涵體的形成）；

3. 細(xì)菌裂解液過柱子，帶標(biāo)簽的誘餌蛋白被特異結(jié)合標(biāo)簽的固相化親和配基捕獲，產(chǎn)生"次級(jí)親和支持物"；

4. 待測樣品裂解液過柱子孵育，與誘餌蛋白互作的蛋白被“次級(jí)親和支持物"吸附；

5. 清洗，離心，去除未結(jié)合的雜蛋白；

6. 洗脫，得到誘餌蛋白及其互作蛋白的復(fù)合物；

7. 如要驗(yàn)證某個(gè)蛋白X與誘餌蛋白互作，則將6.所得的蛋白復(fù)合物與X蛋白的抗體孵育，做Western blot驗(yàn)證；

8. 如要尋找誘餌蛋白可能的互作蛋白，則將6.所得的蛋白復(fù)合物進(jìn)行LC-MS/MS鑒定。

3. 技術(shù)服務(wù)

1. 原核表達(dá)載體構(gòu)建；

2. 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化；

3. pull down捕獲互作蛋白；

4. Western blot驗(yàn)證（兩種目標(biāo)蛋白互作/兩種蛋白互作的結(jié)構(gòu)域）；

5. LC-MS/MS鑒定可能的互作蛋白。

4. 交付結(jié)果

1. 客觀公正的實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)和分析結(jié)果；

2. 提供詳細(xì)、完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

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