要了解
細胞凋亡檢測方法,首先要了解細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化,形態(tài)學(xué)觀察表明細胞凋亡的變化是多階段的。細胞凋亡往往涉及多個細胞,甚至少數(shù)細胞也異步發(fā)生。首先細胞體積縮小,連接消失,與周圍細胞分離,然后細胞質(zhì)密度增加,隨后會發(fā)生一系列變化:線粒體膜電位消失;滲透率變化;將細胞c釋放到細胞質(zhì)中;核質(zhì)濃度、核膜和核仁碎裂;DNA被降解成180bp-200bp左右的片段,在細胞膜內(nèi)形成囊泡;絲氨酸膜表面轉(zhuǎn)向磷脂膜內(nèi)側(cè);細胞膜結(jié)構(gòu)仍然完好無損??梢詫⒌蛲黾毎臍埡》指畎扇舾蓚€凋亡小體而不會溢出。
細胞凋亡檢測通常包括形態(tài)學(xué)觀察、DNA凝膠電泳、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、核小體試驗、流式細胞術(shù)和Westernblot檢測。
1、形態(tài)觀察
電鏡觀察:可見凋亡細胞表面微絨毛消失,核染色質(zhì)固縮和邊緣聚集,常呈新月形,核膜皺縮,細胞質(zhì)致密,細胞器集中,膜泡或“芽”和凋亡小體和凋亡小體被相鄰的吞噬細胞吞噬。
2、DNA凝膠電泳
細胞凋亡的主要生化特征是染色質(zhì)凝聚。染色質(zhì)DNA在核小體單元之間的連接處斷裂,形成一個180~200bp的整數(shù)寡核苷酸片段。該方法是判斷細胞是否發(fā)生凋亡的簡單方法,更適用于體外培養(yǎng)的非增殖細胞的檢測。
3、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)核小體試驗
凋亡細胞的DNA斷裂導(dǎo)致細胞質(zhì)中出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片段組成,可通過ELISA檢測。
細胞凋亡檢測步驟:
(1)將凋亡細胞裂解并高速離心,上清液中含有核小體;
?。?)微量定量板上吸附組蛋白;
?。?)此外,抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合;
?。?)辛辣過氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體與核小體上的DNA結(jié)合;
(5)酶加底物,光度吸收值。