細(xì)胞培養(yǎng)

一、產(chǎn)品介紹

細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)得到大量的細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物。細(xì)胞的生長(zhǎng)需要營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，用于維持細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)基。培養(yǎng)基按其物理狀態(tài)可分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。

細(xì)胞培養(yǎng)是指從動(dòng)物活體體內(nèi)取出組織，于模擬體內(nèi)生理環(huán)境等特定的體內(nèi)條件下，進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之生存并生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、新藥研發(fā)等各個(gè)領(lǐng)域。

二、過(guò)程介紹

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，涉及到多個(gè)基本實(shí)驗(yàn)操作，例如：復(fù)蘇、換液、傳代、凍存等。

復(fù)蘇

1.把凍存管從液氮中取出來(lái)，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動(dòng)(注意防止蓋子不緊致使液體進(jìn)入凍存管)。液體都融化后(大概1-1.5分鐘)，拿出來(lái)噴點(diǎn)酒精放到超凈工作臺(tái)里。

2.把上述細(xì)胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細(xì)胞都洗下來(lái))，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。

3.把上清液倒掉，加1ml培養(yǎng)基把細(xì)胞懸浮起來(lái)。吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中前后左右輕輕搖動(dòng)，使培養(yǎng)皿中的細(xì)胞均勻分布。

4.標(biāo)好細(xì)胞種類和日期、培養(yǎng)人名字等，放到37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5.根據(jù)細(xì)胞增長(zhǎng)速度2-3天換一次培養(yǎng)基。

換液（以貼壁細(xì)胞為例）

1.培養(yǎng)一段時(shí)間后，細(xì)胞還未長(zhǎng)滿，而細(xì)胞培養(yǎng)基顏色由紅色逐漸變黃，說(shuō)明培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，需要及時(shí)換液。

2.吸掉原有培養(yǎng)基。

3.加入等體積新的*培養(yǎng)基。

4.放到37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

5.培養(yǎng)過(guò)程中，要定期觀察細(xì)胞狀態(tài)。如果細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%需要準(zhǔn)備傳代。

傳代（以貼壁細(xì)胞為例）

1.培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%-90%時(shí)要傳代。

2.把原有培養(yǎng)基吸掉。

3.加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌?能覆蓋細(xì)胞就行)，消化1-2分鐘。

4.細(xì)胞都變圓后加入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化。

5.用移液槍吹打細(xì)胞，讓細(xì)胞懸浮起來(lái)。

6.把細(xì)胞吸到10ml或15ml的離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。

7.倒掉上清液，加1-2ml培養(yǎng)基，把細(xì)胞都吹起來(lái)。

8.根據(jù)細(xì)胞種類把細(xì)胞傳到幾個(gè)培養(yǎng)皿中，一般1: 2~3傳代。

凍存

把細(xì)胞消化下來(lái)并離心(同上)。用配好的凍存液把細(xì)胞懸浮起來(lái)，分裝到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃ 過(guò)夜，然后放到液氮灌中保存。

凍存液的配制:80%的*培養(yǎng)基+10?S+10%DMSO。注意：DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。

三、根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，需要選擇不同方法進(jìn)行細(xì)胞傳代

◆ 貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代；

◆ 部分貼壁生長(zhǎng)（半懸浮生長(zhǎng)）的細(xì)胞用直接吹打可傳代；

◆ 懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。

1.  貼壁細(xì)胞的消化法傳代：

1）先吸除或倒掉瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。

2）D-Hanks液洗2～3次。

3）向瓶?jī)?nèi)加入適量消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。（注意：胰蛋白酶要預(yù)溫，溫度37℃左右為宜。）

4）消化最好在37℃環(huán)境下進(jìn)行，消化2～5 min 后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化。

5）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶把殘留消化液沖掉，再添加培養(yǎng)液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養(yǎng)液，終止消化。

6）用彎頭吸管，吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞。從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到，使細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過(guò)猛。

7） 細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別接種在新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。

8）置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（注意：要定時(shí)觀察細(xì)胞，如發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)及時(shí)處理。）

2.  懸浮細(xì)胞的傳代：懸浮細(xì)胞傳代可離心收集細(xì)胞后傳代，或直接傳代。

離心傳代法：

1） 將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到15 ml 離心管內(nèi)。

2） 800~1000 rpm離心5 min。（注意：離心轉(zhuǎn)速要合適。轉(zhuǎn)速過(guò)低，不能有效分離細(xì)胞；離心速度過(guò)大，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)擠壓細(xì)胞造成損傷甚至死亡。）

3） 棄去上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打形成細(xì)胞懸液。

4） 計(jì)數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。

直接傳代法：讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清液吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后再傳代。

3.  部分貼壁細(xì)胞的傳代

1）部分貼壁不牢的細(xì)胞，如Hela細(xì)胞等，不經(jīng)消化處理直接吹打可使細(xì)胞從壁上脫落下來(lái)，而進(jìn)行傳代。

2）對(duì)絕大部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，因直接吹打?qū)?xì)胞損傷較大，細(xì)胞常有較大數(shù)量的丟失，因而需消化后，才能吹打傳代。

四、細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：

1）能長(zhǎng)期傳代，保持活性，便于監(jiān)控檢測(cè)結(jié)構(gòu)功能和生命活動(dòng)。

2）培養(yǎng)條件可以人為的控制便于研究細(xì)胞代謝、物理、化學(xué)、生物因素的影響

3）可用于各種觀察和檢測(cè)手段研究活細(xì)胞的變化(變異、分化)。可從細(xì)胞水平開展亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝分子的表達(dá)。

4）研究范圍和細(xì)胞來(lái)源廣泛，選擇性廣。

5）不同代次細(xì)胞可長(zhǎng)期保存，既可開展同代次不同條件和方法研究，又可觀察不同代次的動(dòng)態(tài)變化。

6）耗資少、經(jīng)濟(jì)、成本低、可大量培養(yǎng)，利于生物制品的生產(chǎn)。

缺點(diǎn)：

細(xì)胞或組織生長(zhǎng)在人工環(huán)境中，與體內(nèi)環(huán)境存在差異，細(xì)胞或組織的形態(tài)或功能會(huì)發(fā)生不同程度的改變。