細(xì)胞培養(yǎng)基

一、常用的細(xì)胞培養(yǎng)基介紹

1. BME培養(yǎng)基，基礎(chǔ) Eagle 培養(yǎng)基（basal medium eagle)

BME培養(yǎng)基是一種廣泛使用的合成基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可支持很多種類的哺乳動物細(xì)胞生長。BME 最初由 Harry Eagle 針對 HeLa 細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞開發(fā)，其發(fā)現(xiàn)了體外細(xì)胞生長的zui 低要求。BME 不含蛋白、脂類或生長因子。因此，BME 需要添加劑。

2. MEM培養(yǎng)基（Minimum Eagle's Medium）

MEM培養(yǎng)基是所有培養(yǎng)基中zui常用的一種，可用于多種懸浮和貼壁生長的哺乳動物細(xì)胞，包括 HeLa、BHK-21、293、HEP-2、HT-1080、MCF-7、成纖維細(xì)胞和原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞。

3. DMEM培養(yǎng)基，Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）

DMEM培養(yǎng)基是一種廣泛使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可用于支持很多種類的哺乳動物細(xì)胞生長。已經(jīng)在 DMEM 中培養(yǎng)成功的細(xì)胞包括原代成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、HUVEC、平滑肌細(xì)胞，以及 HeLa、293、Cos-7 和 PC-12 等細(xì)胞系。

4. IMDM培養(yǎng)基（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）

IMDM培養(yǎng)基是一種高度富集的合成培養(yǎng)基，非常適用于快速增殖的高密度細(xì)胞培養(yǎng)，包括 Jurkat、COS-7 和巨噬細(xì)胞。

5. RPMI-1640培養(yǎng)基（Roswell Park Memorial Institute 1640）

RPMI-1640 培養(yǎng)基被發(fā)現(xiàn)適用于多種哺乳動物細(xì)胞，包括 HeLa 細(xì)胞、Jurkat 細(xì)胞、 MCF-7 細(xì)胞、PC12 細(xì)胞、PBMC 細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和癌細(xì)胞。RPMI 1640 培養(yǎng)基相比其他培養(yǎng)基之所以具有*的效果，是因為其中含有還原劑谷胱甘肽和高濃度的維生素。RPMI 1640 培養(yǎng)基含有生物素、 維生素 B12 以及 PABA，這些成分是 Eagle’s MEM 和DMEM所不具備的。

6. M199培養(yǎng)基（Medium 199）

199 培養(yǎng)基最初配方用于雞胚成纖維細(xì)胞的營養(yǎng)研究。199 培養(yǎng)基由 Earle’s 平衡鹽或 Hanks’ 平衡鹽配制而成。由 Earle’s 平衡鹽配制而成的培養(yǎng)基使用碳酸氫鹽/碳酸系統(tǒng)緩沖液，并在 CO2培養(yǎng)箱中保持 pH 值。 在大氣條件下使用 Earle’s 平衡鹽會導(dǎo)致培養(yǎng)基 pH 值迅速升高。由 Hanks’ 平衡鹽配制而成的 199 培養(yǎng)基使用專為大氣平衡設(shè)計的專用鹽溶液進行緩沖，在CO2 培養(yǎng)箱中使用會令培養(yǎng)基 pH 值迅速下降。

7. McCoy's 5A（改良）培養(yǎng)基（McCoy's 5A (Modified) Medium）

McCoy's 5 A （改良）培養(yǎng)基是一種通用培養(yǎng)基，可支持多種類型原代細(xì)胞、成熟細(xì)胞系以及活檢組織塊的增殖。這種培養(yǎng)基可支持源自正常骨髓、皮膚、脾臟、腎臟、肺、大鼠胚胎及其他組織的原代哺乳動物細(xì)胞的生長。Thomas McCoy 博士起初將 McCoy's5 A 培養(yǎng)基配制為基礎(chǔ)培養(yǎng)基 5 A 的改良版本。與其他培養(yǎng)基不同，McCoy's5 A 包含還原劑谷胱甘肽、細(xì)菌蛋白胨和高濃度葡萄糖。McCoy's 5A（改良）培養(yǎng)基使用碳酸氫鈉緩沖體系 (2.2 g/L)，因此需要 5–10% CO2 的環(huán)境來維持生理 pH 值。

8. Ham's F-12營養(yǎng)培養(yǎng)基

Ham's F-12 營養(yǎng)混合物 (F-12) 起初設(shè)計用于中國倉鼠卵巢 (CHO) 細(xì)胞的無血清單細(xì)胞鋪板。自此之后，F(xiàn)-12 已用于 CHO 培養(yǎng)物的無血清生長以及其他哺乳動物細(xì)胞的添加血清生長，包括軟骨細(xì)胞和大鼠前列腺上皮細(xì)胞。與其他基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，F(xiàn)-12 含有更廣泛的成分，包括鋅、腐胺、Hypoxanthine和胸苷。CHO 細(xì)胞在 F-12 中的無血清生長催生了各種改良配方。

9. Leibovitz L15培養(yǎng)基

Leibovitz L-15 培養(yǎng)基支持 HEP-2 猴腎臟細(xì)胞以及胚胎和成人組織的原代組織塊生長。L-15 采用磷酸鹽和游離氨基酸而非碳酸氫鈉進行緩沖。這種培養(yǎng)基適用于支持非 CO2 平衡環(huán)境中的細(xì)胞生長。L-15 不含蛋白、脂質(zhì)或生長因子。

10. Neurobasal培養(yǎng)基

Neurobasal 培養(yǎng)基是一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)計用于純產(chǎn)前和胚胎神經(jīng)元細(xì)胞群的長期維持和成熟，在與 Gibco B-27 補充劑配合使用時無需星形膠質(zhì)細(xì)胞滋養(yǎng)層。Neurobasal 培養(yǎng)基適用于大多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞應(yīng)用。

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二、常用的細(xì)胞培養(yǎng)基配套試劑(緩沖液、平衡鹽溶液等)

1、無鈣、鎂、離子溶液(1000ml)

氯化鈉(NaCl)8g磷酸二氫鈉、(NaH2PO4H20)0.05g、Potassium chloride (KCl)0.2g、碳酸氫鈉(NaHCO3)1g、檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7,H20)1g、葡萄糖1g、加去離子水或雙蒸水至1000mL

2、PBS(Phosphate-Buffered saline)磷酸鹽緩沖液

甲液:0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液、磷酸氫二鈉(無水)28.4g、氯化鈉8.77g加去離子水或雙蒸水至1000mL

乙液:0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液、磷酸二氫鈉(無水)2.4g、氯化鈉8.77g加去離子水或雙蒸水至1000mL

甲、乙液于4℃保存，使用時按表3-2所示比例，配制成所需pH濃度，高壓滅菌后室溫保存。

3、Hanks液(HBSSHank's Balanced salt solution)

⑴母液甲(20x)配法

①NaCl(A.R)160g、KCl(A.R)8g、MgSO4.7H2O(A.R)2g、MgCl.6H2O(A.R)2g依次溶于800mL雙蒸水中，前一物質(zhì)溶后再加后一種。

②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL雙蒸水中，溶時不斷攪拌(此液應(yīng)單配，單溶)。

待上述兩溶液中的"溶質(zhì)"全溶后，將它們混合，再用雙蒸水補至1000mL，向其中加2mL氯仿作為防腐劑，置4℃保存。

⑵母液乙(20×)配法

①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g、KH2PO4(A.R)1.20g、葡萄糖(A.R)20.0g溶于800ml雙蒸水中。

②0.4%酚紅液0.4g酚紅放在玻璃研缽后加0.01N、NaOH11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，過濾，pH為7.4，4℃保存。

待上述各"溶質(zhì)"*溶解后，用雙蒸水補至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐劑，置40℃保存。

3)使用液(1×)配法

取母液甲和母液乙各一份，加雙蒸水18份，分裝后，塞好瓶塞，掛上標(biāo)志。以115℃高壓滅菌25分鐘(以免葡萄糖破壞)，置室溫后4℃保存，可使用幾個月。臨用前，用7.5%NaHCO3調(diào)至所需pH。

4、Eagle's液(EBSSEagle's Balanced salt solution)

是一種在二氧化碳(CO2)環(huán)境中短期維持細(xì)胞活性的平衡鹽溶液，可用于細(xì)胞解離前的清洗、細(xì)胞或組織的運輸、細(xì)胞計數(shù)時稀釋、溶液的配置等。

5、HEPES液

生物緩沖液，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在PH7.2~7.6范圍內(nèi)，比NaHCO3緩沖液的緩沖能力更強。

6、NaHCO3緩沖液

常規(guī)緩沖體系的一部分，但是不穩(wěn)定，易受空氣中CO2的含量而改變PH值，影響緩沖效果。

三、相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)知識

細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)是指從動物活體體內(nèi)取出組織，于模擬體內(nèi)生理環(huán)境等特定的體內(nèi)條件下，進行孵育培養(yǎng)，使之生存并生長。細(xì)胞培養(yǎng)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、新藥研發(fā)等各個領(lǐng)域。通過細(xì)胞培養(yǎng)得到大量的細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物。細(xì)胞的生長需要營養(yǎng)環(huán)境，用于維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)基。培養(yǎng)基按其物理狀態(tài)可分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。

根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，需要選擇不同方法進行細(xì)胞傳代：

◆ 貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代；

◆ 部分貼壁生長（半懸浮生長）的細(xì)胞用直接吹打可傳代；

◆ 懸浮生長的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。

1.  貼壁細(xì)胞的消化法傳代：

1）先吸除或倒掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。

2）D-Hanks液洗2～3次。

3）向瓶內(nèi)加入適量消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。（注意：胰蛋白酶要預(yù)溫，溫度37℃左右為宜。）

4）消化最好在37℃環(huán)境下進行，消化2～5 min 后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化。

5）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶把殘留消化液沖掉，再添加培養(yǎng)液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養(yǎng)液，終止消化。

6）用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞。從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到，使細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。吹打時動作要輕柔，不要用力過猛。

7） 細(xì)胞計數(shù)后分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

8）置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（注意：要定時觀察細(xì)胞，如發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)及時處理。）

2.  懸浮細(xì)胞的傳代：懸浮細(xì)胞傳代可離心收集細(xì)胞后傳代，或直接傳代。

離心傳代法：

1） 將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到15 ml 離心管內(nèi)。

2） 800~1000 rpm離心5 min。（注意：離心轉(zhuǎn)速要合適。轉(zhuǎn)速過低，不能有效分離細(xì)胞；離心速度過大，時間過長，會擠壓細(xì)胞造成損傷甚至死亡。）

3） 棄去上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打形成細(xì)胞懸液。

4） 計數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

直接傳代法：讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清液吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后再傳代。

3.  部分貼壁細(xì)胞的傳代

1）部分貼壁不牢的細(xì)胞，如Hela細(xì)胞等，不經(jīng)消化處理直接吹打可使細(xì)胞從壁上脫落下來，而進行傳代。

2）對絕大部分貼壁生長的細(xì)胞，因直接吹打?qū)?xì)胞損傷較大，細(xì)胞常有較大數(shù)量的丟失，因而需消化后，才能吹打傳代。